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新冠病毒核酸RT-PCR檢測
新冠病毒
新型冠狀病毒(嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2,Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2),最初發(fā)現于2019年,也可稱(chēng)為2019新型冠狀病毒。是乙型冠狀病毒中的一個(gè)分型,與2003年SARS病毒相似。該病毒株以前從未在人體中發(fā)現,人感染后會(huì )出現呼吸道癥狀、咳嗽、發(fā)燒、呼吸困難,部分患者嗅覺(jué)味覺(jué)消失,嚴重的病例中出現嚴重的呼吸綜合征、肺炎、肺纖維化、腎衰竭,甚至死亡。該病毒主要通過(guò)上呼吸道入侵人體,主要感染肺、心臟、腎等多種器官。
該病毒具有包膜的、不分節段的正鏈單股RNA病毒,顆粒呈圓形或橢圓形,直徑約80~120nm。具有包膜的正鏈單鏈RNA病毒,較容易突變,目前多種變種在全球發(fā)現。
目前病毒檢測主要是核酸檢測和抗原檢測。核酸檢測在病毒感染后就可以檢測出,是檢測病毒感染與否的直接證據,抗原抗體檢測是患者感染3d后出現抗體,是檢測病毒感染的間接證據。
核酸檢測主要是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測新冠病毒保守的片段區域的序列,以確定體內是否含有該病毒。當定量PCR檢測出有該序列,說(shuō)明有可能感染了病毒,會(huì )通過(guò)多次PCR進(jìn)行檢測并結合臨床檢測指標進(jìn)行確診。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用Taqman法進(jìn)行檢測,使用針對病毒2個(gè)或更多的保守區域特異性引物和探針(不同國家或地區檢測的區域不一致,我國主要是檢測ORF1ab和N區域這2個(gè)保守區域)
圖1 新冠病毒基因組圖及PCR靶基因檢測區域
圖2 核酸檢測流程(據Enzolifesciences)
咽拭子樣本采集后運送至實(shí)驗室生物安全柜中直接進(jìn)行下列處理,樣本也可以在4℃冰箱中儲存不超過(guò)7天。
(1)預處理:樣本中加入Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)對粘性樣本進(jìn)行預處理。
(2)病毒滅活:將50μl樣本在99℃加熱5min,將病毒滅活。將樣本轉移至離心機中4000rpm離心5min。(有的試劑盒需要提取核酸)
(3)逆轉錄+PCR檢測:取5μl樣本加入逆轉錄和PCR反應體系中。
反應體系包含:逆轉錄酶、DNA聚合酶、特異性引物、特異性probe,并使用乙肝病毒HBVS抗原序列作為內控。
PCR mix體系
成分 | 體積(μl) |
RT-PCR mix | 12.5 |
forward primer | 400nM |
reverse primer | 400nM |
PCR probe | 200nM |
sample | 5 |
Rnase free H2O | up to 25 |
total | 25 |
PCR反應程序
程序 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數 | |
逆轉錄 | 99℃ | 30s | 變性 | 1cycle |
60℃ | 5min | 逆轉錄 | ||
PCR | 90℃ | 5s | 變性 | 45cycle |
60℃ | 30s | 退火/延伸 |
(4)結果判讀:
PCR檢測結束后,定量PCR儀會(huì )有每個(gè)樣本檢測的Ct值,當檢測樣本兩個(gè)檢測位點(diǎn)無(wú)Ct值或者>38時(shí),判斷為陰性,當兩個(gè)檢測位點(diǎn)Ct值<38時(shí),是陽(yáng)性,當兩個(gè)檢測位點(diǎn)Ct值在38左右不一致是,需要再次進(jìn)行復檢。
當Ct值陽(yáng)性時(shí),醫生會(huì )結合流行病學(xué)接觸史和影像學(xué)檢查結合進(jìn)行綜合判斷。
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