細胞生物學(xué)平臺

細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細胞生物，以細胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體。多細胞生物，以細胞分裂的方式產(chǎn)生新的細胞，用來(lái)補充體內衰老或死亡的細胞。細胞實(shí)驗中原代細胞和腫瘤細胞株均有增殖能力，為檢測研究的藥物或者基因的變化對細胞的增殖的影響，一般會(huì )使用MTT檢測、CCK8檢測、BrdU染色、EdU染色等實(shí)驗。
1 MTT檢測
MTT 是一種檢測細胞存活和生長(cháng)的方法。其檢測原理為活細胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 570nm 波長(cháng)處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。適合貼壁細胞，不適合懸浮細胞檢測。
實(shí)驗流程：
1.1、使用血球計數板對細胞計數計數，接種3000-5000個(gè)細胞至96孔板，輕輕搖晃均勻后放入培養箱培養過(guò)夜；
1.2、根據實(shí)驗目的進(jìn)行加藥或其他處理；
1.3、細胞培養到指定時(shí)間點(diǎn)后，加入10μl MTT溶液，輕輕混勻后放入培養箱中培養3h；
1.4、去除培養基，加入DMSO溶液，輕輕搖晃將96孔板放入酶標儀檢測。
2 CCK8檢測
Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類(lèi)似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線(xiàn)粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細胞增殖越多越快，顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細胞，顏色的深淺與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細胞增殖和毒性分析。懸浮細胞和貼壁細胞均可以進(jìn)行檢測。
實(shí)驗流程：
2.1、使用血球計數板對細胞計數計數，接種3000-5000個(gè)細胞至96孔板，輕輕搖晃均勻后放入培養箱培養過(guò)夜；
2.2、根據實(shí)驗目的進(jìn)行加藥或其他處理；
2.3、細胞培養到指定時(shí)間點(diǎn)后，加入10μl CCK8溶液，輕輕混勻后放入培養箱中培養2-4h；
2.4、將96孔板放入酶標儀檢測。
3 BrdU染色檢測
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于標記活性中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復制細胞中新合成的DNA中（細胞周期S期）。隨著(zhù)DNA復制可以可以進(jìn)入子細胞中，BrdU特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。
EdU和BrdU類(lèi)似，另一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物。它也能夠在細胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子，通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性，通過(guò)檢測EdU標記便能準確地反映細胞的增殖情況。具體操作和BrdU類(lèi)似。
實(shí)驗流程：
3.1、接種5×10⁵個(gè)細胞于玻璃底培養皿中，搖晃均勻后放入培養箱培養過(guò)夜，根據實(shí)驗目的加入藥物或其他處理。
3.2、制備適量50μM BrdU培養基，37℃，孵育2h。除去培養液，用PBS洗滌3次。
3.3、加入4%多聚甲醛常溫固定10min。
3.4、將多聚甲醛去除，加入預冷的PBS洗3次，每次5min。
3.5、加入含0.5% Triton X-100的PBS，在冰上將細胞膜穿刺10min。
3.6、去除PBS-Triton，加入預冷的PBS洗3次，每次5min。
3.7、加入PBS-3%BSA，常溫封閉30min。
3.8、將BrdU抗體按照1:100的比例稀釋在PBS-1%BSA溶液中，去除封閉液后，加入一抗，室溫孵育2h或者4℃孵育過(guò)夜。
3.9、去除一抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.10、將熒光二抗分別按照1:400比例稀釋在PBS-1%BSA溶液中，去除PBS-T后，加入二抗，室溫避光孵育1h。
3.11、去除二抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.12、加入100ng/mL DAPI溶液，室溫避光孵育10min。
3.13、去除DAPI，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.14、加入防熒光淬滅溶液，4℃避光放置或直接在激光共聚焦顯微鏡拍照。
4 細胞克隆形成實(shí)驗
細胞克隆形成實(shí)驗是檢測單個(gè)細胞增殖能力的實(shí)驗方法。當一個(gè)細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，形成克隆，每個(gè)克隆含有50以上的細胞，大小在0.2-1mm之間，集落的大小和數量反應該細胞獨立生存能力和增殖能力，從而該實(shí)驗反應細胞增殖的情況。
實(shí)驗流程：
4.1、接種500個(gè)細胞于六孔板中，輕輕混勻后放入培養箱中培養；
4.2、培養過(guò)夜后，根據實(shí)驗目的加入藥物或其他處理；
4.3、每隔3天更換一次培養基，培養2周后，去除培養基，加入PBS洗一次；
4.4、加入4%多聚甲醛或者乙醇固定10min，去除培養基，加入結晶紫染色液，常溫染色20min；
4.5、加入PBS洗3次，將六孔板放入烘箱中烘干，對克隆進(jìn)行計數和拍照。
 

圖 細胞增殖能力實(shí)驗檢測
A MTT和CCK8檢測圖； B BrdU染色檢測圖及統計圖； C 細胞克隆形成檢測圖及統計圖