分子生物學(xué)平臺

RNA pull down：RNA沉淀檢測，是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗方法之一。使用體外轉錄將RNA進(jìn)行生物素標記，并與細胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復合物。復合物通過(guò)磁珠結合后分離，復合物純化洗脫后通過(guò)Western blot驗證檢測特性的蛋白。若篩選可能結合的蛋白通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗進(jìn)行檢測篩選。

實(shí)驗流程：

2.1生物素探針標記RNA
1 取出RNA 3' End Desthiobiotinylation試劑盒，將試劑盒中的PEG及DMSO置于常溫，其余組分置于冰上融化；
2 依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，將濃度調整至10ug/管，用10μl DEPC水溶解。同時(shí)溶解試劑盒中Control RNA作為陰性對照；
3 取對照RNA及目標RNA各5μl，放于200 μl的PCR管中，每管可加1μl DMSO，混勻后置于PCR儀上，85℃，5min，然后立即置于冰上5min；
4 按照下表配制探針標記反應的體系：

5 混勻上述反應體系，之后放至PCR儀內，16℃，4h至過(guò)夜。反應時(shí)間的延長(cháng)可提高連接效率；連接反應結束后，向每管加400μl nuclease free-water；
6 每管加300μl酚氯仿提取標記成功的RNA；渦旋后最大轉速離心15min，小心將上層水相移取到新的EP管中；
7 加10μl 5M NaCl，2μl糖原，以及600μl 預冷的100%乙醇，放于-20℃或-80℃沉淀，可沉淀過(guò)夜。

2 細胞蛋白裂解
1 細胞培養在15cm培養皿中，當細胞長(cháng)至80-90%時(shí)，棄去培養基，用預冷的PBS洗3次，吸去上清；
2 每個(gè)培養皿中加入200μl cell lysis buffer；
3 用細胞刮將細胞刮下，轉移至EP管，液氮中反復凍融3次；
4 離心，4℃，3000rpm，離心10min；
5 將上清轉移至新的EP管中，置于冰上；加200U/ml RNase Inhibitor;
6 取10-20μl左右上清至新管中，作為實(shí)驗input。

3 RNA沉淀
1 將沉淀過(guò)夜的RNA取出，4℃，最大轉速離心30min，離心后可見(jiàn)管底的白色沉淀為RNA；
2 小心移取上清，用1ml 70%乙醇洗滌，8000rpm 離心10min,之后吸凈管內液體，空氣中晾干RNA；
3 每管加20μl nuclease free-water溶解RNA，之后將RNA放于PCR儀中，95℃，5min使其變性，之后立即置于冰上，備用。

4 磁珠預處理
1取50μl磁珠至離心管中，置于磁力架上，吸去上清。加入1ml 20mM的Tris-HCl（pH7.5），清洗磁珠后置于磁力架上，吸去上清，重復洗一次。
2 用800μl 1×binding & washing buffer，洗3次，吸去上清；

5 RNA 與beads結合
1 向的beads中加入400μl 2×binding & washing buffer；
2 向上一步中加入50pmo已標記的RNA，再補380μl DEPC水，使其終體積為800μl；
3 室溫慢速旋轉20min，使beads與RNA充分結合，室溫孵育15-30min；
4 將上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；
5 用800μl 1X binding & washing buffer（含RNase Inhibitor, 1U/ μl），洗3次，去除上清；
6 用cell lysis buffer A洗一次beads，吸去上清，注意不要讓beads干掉。

6 RNA與蛋白相互作用檢測
1 向上一步已處理好的beads中每管加入500μl 細胞裂解液；同時(shí)每管加入1U/ μl濃度的RNase Inhibitor；
2 4℃慢速旋轉2h，使beads與細胞裂解液充分結合；
3 置于磁力架上吸去上清，用400 μl新鮮配制的cell lysis buffer A（+RNase Inhibitor+蛋白酶抑制劑），洗5次beads;
4 吸去上清，加入50ul的Elution buffer，輕輕將磁珠吹勻，置于37℃孵育30min，置于磁力架上，收集上清，做Western blot檢測或者質(zhì)譜檢測。

7 質(zhì)譜
將每個(gè)樣品中富集的蛋白質(zhì)（100 ug）加到30kDa MWCO旋轉過(guò)濾器上并離心。 通過(guò)將樣品與100μL 30mM IAA和8M尿素的100μL15mM DTT在8 M尿素中在黑暗中孵育，并分別孵育45分鐘，來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)還原和烷基化。 然后將樣品分別用100μL 8M尿素和100μL 50mM TEAB洗滌兩次。以1:50的酶與蛋白質(zhì)比例添加200μL 50mM TEAB中的胰蛋白酶。在37°C消化16小時(shí)后，通過(guò)離心將胰蛋白酶肽收集在新試管中。再次進(jìn)行200μL 50mM TEAB洗滌。FASP方案中的所有離心步驟均以14,000xg進(jìn)行15分鐘。
胰蛋白酶肽在Speed Vac中干燥。然后將肽重懸于20μLiTRAQ溶出緩沖液（0.5M TEAB）中，并根據制造商的8-plex iTRAQ方案進(jìn)行標記。如表3所示，使用了兩個(gè)獨立的8重iTRAQ組以容納所有16個(gè)樣品，如表3所示。在與iTRAQ試劑溫育2小時(shí)后，將所有樣品用碳酸氫銨淬滅，并在每次運行中合并，并通過(guò)Speed Vac濃縮至約30μL。在XBridge RP色譜柱（5μm，150Å，4.6mm X250 mm）上進(jìn)行肽分離。流動(dòng)相A含2％乙腈（ACN），流動(dòng)相B含98％ACN。使用NH4OH將兩者的pH均調節至10.0。溶劑梯度設定如下：2分鐘內2–5％B； 11分鐘內5–18％B；9分鐘內18–32％B；1分鐘內獲得32–95％B；保持在95％B下5分鐘。胰蛋白酶肽以1mL / min的流速分離，并通過(guò)214nm的UV監測。每分鐘收集一次洗脫液，并通過(guò)串聯(lián)將其合并為8個(gè)餾分。將所有流分干燥并重新溶解在10μL的3％ACN和0.1％甲酸中，然后進(jìn)行LC-MS / MS分析。
將肽上樣到反相捕獲柱上。在反相納米柱上進(jìn)行肽分離，線(xiàn)性梯度在90分鐘內為3–25％ACN，在10分鐘內為25-50％ACN，并在3分鐘內達到90％ACN。在Dionex U3000 UPLC系統上以200nl/min的恒定流速在最后5分鐘內保持90％的流速，然后在最后2分鐘內返回3％ACN，最后保持2分鐘。流動(dòng)相均補充有0.1％FA。通過(guò)配備有以2.1 kV操作的納米級的Q Exactive四極-Orbitrap質(zhì)譜儀分析洗脫的肽。
LC-MS / MS數據是通過(guò)數據依賴(lài)分析（DDA）方案收集的，包括從400到1,200Th的完整MS調查掃描，分辨率為70,000 FWHM（在m / z 200 Th），并具有自動(dòng)增益控制（AGC）設置為1e6，然后進(jìn)行MS2掃描，選擇20個(gè)最強的峰，以便通過(guò)高能碰撞解離（HCD）進(jìn)行裂解。歸一化碰撞能量設置為32％。 所有MS2光譜均以17,500 FWHM分辨率獲得，并且AGC設置為2e5。
使用MS2報告離子8plex iTRAQ定量方案，使用MaxQuant（1.6.1.0版）處理所得原始數據。再與反向誘餌數據庫連接的犬UniProt數據庫中搜索MS2光譜。胰蛋白酶/ P被指定為裂解酶，最多允許2個(gè)缺失的裂解。對于前體離子，質(zhì)量誤差設置為10 ppm，對于碎片離子，質(zhì)量誤差設置為0.02 Da。將Cys上的氨基甲酰甲基化指定為固定修飾，將Met上的氧化和蛋白質(zhì)N端的乙?；付榭勺冃揎?。將蛋白質(zhì)和肽的FDR水平設置為0.01以過(guò)濾結果。每次運行中所有樣品中具有超過(guò)2個(gè)MS2光譜且非零iTRAQ報告離子強度的蛋白質(zhì)都用于蛋白質(zhì)定量。
使用學(xué)生t檢驗（p<0.05）選擇差異表達的蛋白質(zhì)。 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）和STRING（http://www.string-db.org/）用于基因聚類(lèi)分析（GO）注釋和功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò )分析。
 
實(shí)驗結果示例：

圖 RNA pulldown質(zhì)譜檢測示例圖
A RNA pulldown蛋白銀染示例圖。B,C 質(zhì)譜檢測結果GO聚類(lèi)分析示例圖。D,E 質(zhì)譜檢測結果KEGG信號通路分析示例圖。F 篩選出蛋白相互作用圖