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雙熒光素酶報告基因檢測


 

熒光素酶報告實(shí)驗由于其快捷、廉價(jià)、靈敏度高和可定量等優(yōu)點(diǎn)，已普遍用于細胞生物學(xué)的研究，如基因表達轉錄水平的研究。熒光素酶報告系統屬于生物發(fā)光系統，其中的熒光素酶來(lái)自于不同生物體內的氧化酶，很多物種（細菌、海洋動(dòng)物、昆蟲(chóng)等）中都含有熒光素酶，其中應用比較廣泛的是熒火蟲(chóng)熒光素酶。它可以在一定條件下與底物發(fā)生化學(xué)反應產(chǎn)生可檢測到的光，產(chǎn)生光的過(guò)程中幾乎不產(chǎn)生熱量，也就是說(shuō)這個(gè)過(guò)程中幾乎所有的能量全部轉化為光能，這使得檢測的靈敏度非常高。下面以報告基因實(shí)驗（啟動(dòng)子）為例，來(lái)介紹雙熒光素酶報告系統。
 

 熒光素酶反應原理

 
報告基因實(shí)驗常用于研究目的基因的調控元件（啟動(dòng)子、增強子等），調控元件的DNA結合域和順式作用元件實(shí)現共價(jià)結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。整個(gè)報告基因的核心是將待定的調控元件與報告基因進(jìn)行融合，檢測報告基因的表達。由于報告基因的表達完全取決待定的調控元件，故報告基因的表達量與待定調控元件的活性直接相關(guān)。一個(gè)好的報告基因必須滿(mǎn)足以下條件：
（1）在所檢測的細胞內不存在；
（2）檢測起來(lái)非常方便；
（3）靈敏度要高，最好可以定量。相比于傳統的β-半乳糖苷酶（LacZ，真核生物內有內源性干擾）、氯霉素乙酰轉移酶（CAT，檢測復雜）、熒光蛋白（GFP、YFP、RFP等，靈敏度不高，有些細胞有自發(fā)熒光現象），熒光素酶檢測系統具有明顯的優(yōu)勢。
 

 
熒光素酶報告實(shí)驗圖解

 
由于熒光素酶超級靈敏的能力和寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍，熒光素酶系統得到了廣泛的使用。通常熒光素酶的實(shí)驗會(huì )將待檢測的調控元件（啟動(dòng)子）安排在熒光素酶基因的上游，構建成載體，然后將構建完成的載體導入到合適的動(dòng)物細胞中，通過(guò)檢測熒光素酶的活性來(lái)判斷調控元件的活性。
在熒光素酶報告系統中，只使用一種熒光素酶（一般為熒火蟲(chóng)熒光素酶），為單熒光素酶報告實(shí)驗；由于不同的熒光素酶所發(fā)出的光具有不同的光譜性質(zhì)，或使用不同的底物，一個(gè)報告實(shí)驗中也可以使用兩種或多種熒光素酶，其中最常用到的就是雙熒光素酶（一般為熒火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶）報告實(shí)驗，其中一種熒光素酶作為報告基因，另一種則作為內參，主要作用是減少外界因素對于實(shí)驗數據產(chǎn)生的影響，這些影響主要包括操作誤差、細胞接種差異、細胞處理的誤差、孔間增殖差異等因素。因此，在調控元件（啟動(dòng)子、增強子）的研究中，雙熒光素酶報告實(shí)驗應用的會(huì )更多一些，整個(gè)的實(shí)驗過(guò)程也非常的簡(jiǎn)便，如下圖所示。
 

 
  熒光素酶報告實(shí)驗流程

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