細胞生物學(xué)平臺

慢病毒建立穩轉細胞系
 

慢病毒（Lentivirus）是一種逆轉錄病毒，為雙鏈RNA。不同于一般的病毒，慢病毒具有更廣泛的宿主，對正在分裂的細胞和非分裂的細胞均具有感染能力。重組慢病毒載體是以HIV-1為基礎，使用皰疹病毒VSVG 外殼蛋白發(fā)展起來(lái)的工具載體，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而可以在宿主細胞中持久性表達。
目前實(shí)驗使用的病毒主要為慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉錄病毒。
慢病毒與其他病毒比較，具有以下優(yōu)勢：
1安全性高：由于慢病毒剔除毒性基因，目前實(shí)驗未發(fā)現致病性，已被用于CAR-T治療于人體；
2 表達時(shí)間長(cháng)：慢病毒通過(guò)將外源基因整合到宿主細胞基因組上，可實(shí)現目的基因長(cháng)時(shí)間穩定的表達，不隨著(zhù)細胞分裂傳代而丟失，是細胞實(shí)驗的首選；
3 免疫原性低： 直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動(dòng)物實(shí)驗。
 
實(shí)驗流程：
1 慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統，慢病毒系統使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過(guò)表達慢病毒系統使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉染方法瞬時(shí)轉染至HEK293T細胞中，輕輕混勻后放入培養箱中培養48h后，收集上清。使用genecopoeia公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
2 滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋?zhuān)謩e感染293T細胞，感染72h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算病毒滴度。
3 細胞感染：在病毒感染前一天對細胞進(jìn)行計數，接種約10000個(gè)細胞于12孔板中，培養過(guò)夜后使用無(wú)血清培養基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進(jìn)行感染，病毒數量根據推薦細胞的感染MOI加入（若無(wú)推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個(gè)梯度對細胞感染），感染6h后去除含病毒溶液，加入完全培養基細胞培養，培養48h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞熒光強度。同時(shí)加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩定表達情況。

結果示例：

圖 病毒感染后細胞熒光示例圖
A MOI檢測，不同濃度病毒對細胞感染后，熒光表達變化。B 2種貼壁細胞病毒感染后熒光表達情況