細胞生物學(xué)平臺

流式細胞術(shù)檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個(gè)細胞，進(jìn)入下一個(gè)細胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區分，細胞開(kāi)始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開(kāi)始合成，細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當DNA復制成為4倍體時(shí)，細胞進(jìn)入G2期。G2期細胞繼續合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。
PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個(gè)期的百分含量。
實(shí)驗流程：
1  貼壁細胞：
1.1、細胞經(jīng)過(guò)相應的培養刺激后，輕輕去除培養基，加入PBS輕輕搖晃去除PBS；
1.2、加入1ml胰酶，搖晃均勻后放入培養箱中消化（細胞不同消化時(shí)間不同）；
1.3、消化結束后，將細胞從培養箱中取出，加入3ml含血清的培養基終止胰酶消化，使用移液器將細胞重懸轉移至離心管中；
1.4、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入3ml PBS重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入75%酒精重懸固定細胞，放入4℃冰箱中固定過(guò)夜；
1.5、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min；
1.6、上流式細胞儀檢測。
2 懸浮細胞：
2.1、細胞經(jīng)過(guò)相應的培養刺激后，將細胞和培養基全部轉移至離心管中，1000rpm常溫離心5min，去除上清；
2.2、加入3ml PBS重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清；
2.3、加入75%酒精重懸固定細胞，放入4℃冰箱中固定過(guò)夜；
2.4、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min；
2.5、上流式細胞儀檢測。
 
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過(guò)程發(fā)生在DNA片段化之前，因而檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴(lài)的磷脂結合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來(lái)識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。
實(shí)驗流程：
1 貼壁細胞：
1.1、細胞經(jīng)過(guò)相應的培養刺激后，將培養基分別轉移至離心管中，加入PBS輕輕搖晃去除PBS；
1.2、加入1ml胰酶，搖晃均勻后放入培養箱中消化（細胞不同消化時(shí)間不同，使用中不含EDTA胰酶）；
1.3、消化結束后，將細胞從培養箱中取出，加入3ml含血清的培養基終止胰酶消化，使用移液器將細胞重懸轉移至含培養上清的離心管中；
1.4、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入3ml PBS重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入1×binding buffer重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清，重復該步驟一次；
1.5、100μl 1×binding buffer重懸細胞，每個(gè)樣本加入5μl AnnexinV和PI染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15min；
1.6、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入500μl PBS重懸細胞，立刻上流式細胞儀檢測。
2 懸浮細胞：
2.1、細胞經(jīng)過(guò)相應的培養刺激后，將細胞和培養基全部轉移至離心管中，1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入3ml PBS重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清；
2.2、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入3ml PBS重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入1×binding buffer重懸細胞，1000rpm常溫離心5min，去除上清，重復該步驟一次；
2.3、100μl 1×binding buffer重懸細胞，每個(gè)樣本加入5μl AnnexinV和PI染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15min；
2.4、1000rpm常溫離心5min，去除上清，加入500μl PBS重懸細胞，立刻上流式細胞儀檢測。

圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖