常見(jiàn)問(wèn)題解答

透射電鏡樣本制備方法和要求

1. 生物樣品負染：滴在銅網(wǎng)上的樣品溶液經(jīng)1-2%的磷鎢酸（PTA，pH6.5-7.0）染色5-10s后干燥，在透射電鏡中觀(guān)察。

2. 生物樣品超薄切片制備流程：材料樣品的超薄切片制備參見(jiàn)步驟2.4和2.5。

樣品取材要求：

（1）新鮮。（材料離體后1-5min內進(jìn)入固定液，避免細胞自溶和結構變化）

（2）體積小。（厚度< 1mm，長(cháng)度寬度均< 5mm，固定液滲透能力有限，組織太大會(huì )導致無(wú)法固定充分）

（3）機械損傷小。（動(dòng)作輕巧，器械鋒利，避免對阻止的擠壓和推拉，建議用剃須刀片、手術(shù)刀片、手術(shù)剪刀。）

（4）低溫操作，器械、容器、固定液均需預冷。（降低酶的活性，減少組織自溶）

（5）取材部位準確，且注意材料的方向性和定位。

2.1取樣&固定：

2.1.1取樣及戊二醛固定

戊二醛（多為2.5%），超純水配成6-10%的水溶液，使用前加0.2M磷酸鈉緩沖液稀釋至所需濃度（有細胞壁的樣品5%，無(wú)細胞壁樣品3%，磷酸緩沖液終濃度0.1M，PH7.2），現配現用?？筛鶕悠愤x擇其他緩沖體系。

切取一小塊組織，置入預冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃預固定20分鐘后，撈出置于潔凈的保鮮膜或培養皿上（已滴有預冷的固定液），在固定液中用將組織切成2-5mm長(cháng)， 2-3mm寬， 1mm厚的細條，移入盛有預冷的戊二醛固定液的2ml離心管中，4℃固定過(guò)夜。

（1）植物細胞的細胞壁和液泡會(huì )阻礙固定液迅速滲入。植物材料內部存有的空氣，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影響到植物組織的固定效果。組織放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出組織內部的氣體，使材料沉入固定液中。

（2）動(dòng)物樣本的取材，可將動(dòng)物麻醉或急性處死后切取組織?；蛘卟捎迷还潭?、流灌固定后再切取所需組織。

（3）細胞培養的樣品，輕微并短暫離心，倒凈培養液后，加入預冷的固定液，4℃固定10min后，低溫6000rpm/min離心5min（離心力不可過(guò)大，離心時(shí)間不可過(guò)長(cháng)，避免機械擠壓，使用1.5ml離心管方便收集細胞），去上清，滴加新鮮固定液并重懸，4℃固定過(guò)夜。

漂洗

2.1.2鋨酸固定

倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min。

       用1%的鋨酸溶液固定樣品1-2h。小心取出鋨酸廢液，用0.1M，pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min；

2.2.脫水

       用梯度濃度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五種濃度）的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理20min；最后過(guò)度到純丙酮處理20min。

2.3滲透

       用包埋劑與丙酮的混合液（V/V=1/1）處理樣品1h：用包埋劑與丙酮的混合液（V/V=3/1）處理樣品3h；純包埋劑處理樣品過(guò)夜。

2.4包埋和聚合

將經(jīng)過(guò)滲透處理的樣品包埋起來(lái)，70℃加熱過(guò)夜，即得到包埋好的樣品。

2.5切片和染色

包埋塊在超薄切片機中切片，獲得100nm的切片，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5-10min，即可在透射電鏡中觀(guān)察。